细胞传代操作步骤

一、   贴壁细胞传代（以一个T25瓶为例）

1、 吸出原培养液；

2、 加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃；

3、 加入1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞，放入培养箱消化；

4、 消化时间跟据细胞特性有所不同，显微镜下看到细胞块中间的细胞明显分离变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化，全程不要拍打培养瓶；

5、 加入3ml含血清的培养基终止消化，吹打细胞使之脱落并在液体里反复吹打使细胞，使之尽量呈单颗细胞的悬浮液，这时可以在显微镜看下；

6、 收集细胞悬液离心，1200rpm（约250g） 3分钟，离心完吸出上清丢弃。

7、 加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。

8、 检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。

二、   悬浮细胞传代（以一个T25瓶为例）

1、 轻轻吹散悬浮细胞，部分贴壁松散的悬浮细胞可直接吹打培养瓶底部使细胞悬浮，收集细胞悬液到无菌离心管中，离心1200rpm（约250g） 3分钟，离心完毕吸出上清丢弃;

2、 加入适量新鲜培养基重悬细胞，按比例接种至培养瓶（接种比例按实际情况，不确定可计数后再接种）;

3、 常规细胞推荐以3~5×10⁵cells/ml传代，长到2×10⁶cells/ml传出;

4、 建议刚开始几代计数后传代，后面可以根据经验按比例传代。

三、     半贴壁半悬浮细胞传代（以一个T25瓶为例）

1、 培养液（含悬浮的细胞）：用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中；

2、 贴壁部分：用1ml PBS洗细胞，吸出PBS放入到第1步装有培养液的离心管中收集（不要直接丢弃，里面有细胞）；

3、 培养瓶加入胰酶1ml，放入培养箱静置消化；

4、 消化时间跟据细胞特性有所不同，显微镜下看到细胞明显收缩变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化，全程不要拍打培养瓶；

5、 用3ml含血清的培养基终止消化，将消化下来的细胞悬液吹散细胞后收集到第1步的离心管；

6、 将离心管在1200rpm（约250g） 3min离心，离心完毕弃掉上清，加入新的培养基重悬，按实际情况分瓶，放入培养箱培养。

温馨提示：

1、 每丢弃一个液体前都要想一下里面有没有可能有细胞，避免丢失细胞。

2、 细胞种类、细胞密度、细胞状态、甚至胰酶的品牌，均影响到细胞的消化时间，所以消化的时候不要只看时间，以显微镜下细胞的状态来确定消化终点，部分难消化的细胞消化时间甚至可以长达15分钟。

3、 细胞的传代比例通常说的是等体积的容器，不同容器需要换算；例如：一个T25培养瓶的细胞传到一个10cm培养皿里面，虽然是1传1，但是比例可不是1:1；T25瓶底面积25cm2，10cm培养皿底面积约为55cm²（10cm的培养皿指的是培养皿的外径，而培养皿的内径约为8.4cm，故根据内径可求出其底面积为55cm²），所以实际传代比例为1:2.2。

4、 在有关离心机的实验中，标准的离心条件应该是用RCF(relative centnifugal fieldt)来衡量，而在实际大家实验过程中，往往习惯用rmp即每分钟转速来表示；RCF即表示相对离心场，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍数来表示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示离心机转轴中心与离心管中心的距离，单位为cm）；所以每个实验室离心机转速设置是不一样的，常规建议1200rpm 大约250g。