Sulfo-Cy5 tetrazine 远红荧光探针的合成步骤

Sulfo-Cy5 tetrazine 远红荧光探针的合成步骤

Sulfo-Cy5 tetrazine 是一种基于花菁染料 Cy5 的远红荧光探针，其结构在 Cy5 骨架两端或侧链引入磺酸基（–SO₃⁻），使其具备高水溶性；同时在分子上引入四嗪（tetrazine）官能团，具备强烈的生物正交反应活性，可与含 TCO（trans-cyclooctene）、DBCO 或环烯烃衍生物发生快速、高选择性、无铜催化的 IEDDA（inverse-electron-demand Diels–Alder）点击反应。因此，Sulfo-Cy5 tetrazine 兼具“高灵敏远红荧光 + 生物正交偶联活性 + 高水溶性”的三重优势，是构建靶向探针、ADC前药、代谢标记、活细胞成像及体内示踪的理想工具。

Cy5 染料具有五亚甲基共轭链和吲哚鎓端基，激发峰约 645 nm，发射峰约 665 nm，信号强、背景低、组织穿透力高，适合深层活体成像。磺酸基提高水溶性、减少非特异结合并提升生物兼容性，使其在细胞或血清中保持稳定不聚集。Tetrazine 具有高反应速率常数（10⁴–10⁶ M⁻¹·s⁻¹），无需金属催化，可用于活细胞甚至动物体内快速偶联。

典型合成步骤如下（概述）：

Cy5 主链合成或购买带活性位点的 Cy5 中间体

通常选择 Cy5-NHS ester、Cy5-COOH 或 Cy5-amine 作为起始原料。

如果需要高水溶性，可选择 pre-sulfonated Cy5（三磺酸或双磺酸形式）。

Tetrazine 片段的制备

常用 3-methyl-6-hydrazinyl-1,2,4,5-tetrazine 或 tetrazine-COOH, tetrazine-NHS ester 作为偶联单元。

Tetrazine 自身可通过二腈缩合或硫脲环化合成，但通常从商业供应商获取纯度高的衍生物。

连接臂设计（可选）

为避免荧光猝灭或空间位阻，常引入 PEG、烷基或二胺连接臂（如 PEG4, PEG8）。

确保连接臂具有一个与 Cy5偶联的基团、一个与 tetrazine 偶联的基团。

偶联反应

若 Cy5 为 NHS ester，与 tetrazine-amine 在碱性条件（pH 8.0，DMSO/水混合）下偶联。

若 Cy5 为 amine，则与 tetrazine-NHS ester 偶联。

若两者为 COOH 与 amine，则使用 EDC/NHS 或 HATU 进行酰胺化偶联。

反应温度一般为室温至40℃，1–4小时。

纯化

采用反相HPLC、制备型LC或离子交换柱去除未反应试剂与副产物。

表征

使用MS、NMR、UV-Vis、荧光光谱验证结构与光谱特性。

终得到的 Sulfo-Cy5 tetrazine 可用于快速标记TCO-修饰的抗体、纳米颗粒、糖分子、细胞膜受体或活体代谢物，是构建生物正交荧光探针的核心试剂。

名称：Sulfo-Cy5 tetrazine

纯度：95%+

规格：mg/g

用途：科研

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仅用于科研，不能用于人体。小编axc