微流控生物反应器内的真菌代谢物筛选

作为无柄生物，植物不能轻易通过搬迁来规避压力源。为了评估所经历的非生物和生物胁迫的质量和数量，植物已经进化出复杂的信号通路。通常，属于潜在病原体的分子是在植物质膜的水平上被识别出来的。识别后，信号从细胞外部传递到细胞中，最终诱导防御反应（如果可能的话）。在病原体触发免疫 （PTI） 中，一种基础防御反应，信号通常在二级信使 Ca 的帮助下传递2+.细胞外间隙含有相对高浓度的 Ca2+，尤其是与细胞质中的浓度并列时。为了对病原体的存在做出反应，Ca2+离子被转运到细胞中，在转录因子的帮助下改变细胞的行为。这个 Ca 的导入2+与 H 跨质膜的转运一起发生。质子的转运导致细胞外 pH 值的变化，这很容易量化。pH 值变化是评估植物是否发生 PTI 反应的常用读数。

为了快速连续筛选多种真菌代谢物的免疫活性，需要一个简单可靠的系统来测量微流体生物反应器 （MBR） 中的 pH 值变化，该系统由 KIT 微结构技术研究所 （IMT） 与 KIT 植物研究所合作开发。因此，设计了一个从 PreSens pH-1 SMA HP5 到 MBR 中相应传感器点 SP-HP5 的可伸缩但可密封的连接器，并在机械和生物实验中进行了检查。MBR 是一种用于培养植物细胞的双室生物反应器（见图 1A）。透膜将培养室和营养流室隔开。它最初是由 IMT 的 Tim Finkbeiner 设计的，然后进一步发展。细胞可以通过椭圆形腔室两端的两个开口带入培养室。开口配有 M5 螺纹，以便用合适的螺钉密封。MBR 可以通过单向流连接到更多的 MBR。因此，留在培养室中的细胞持续获得来自先前 MBR 的新鲜培养基和代谢产物，同时它们自身的代谢产物被运输到下一个 MBR 并带走废物。基本原理是剖析细胞间通讯通路，通过每个 MBR 培养一种细胞来获取有关所涉及的过程和反应的信息。在 MBR 的培养室中培养 Nicotiana tabacum 的 BY2 系细胞时，通过 pH-1 SMA HP5 定量 pH 值。可以将要评估免疫活性的物质添加到供应给细胞的培养基中。如果可以观察到 pH 值的增加，则可以将其解释为目标物质免疫活性的第一个迹象。

图 1：微流控生物反应器 （MBR）：A） MBR 的顶视图和侧视图示意图。它由两个腔室组成，由半透膜隔开，仅允许介质和溶剂通过。B） MBR 和传感器的设置：传感器点 SP-HP5 通过一个连接器安装，该连接器拧入培养室两个螺纹开口的右侧（在这种情况下，第二个开口覆盖有 851 型 3M 聚酯胶带）。传感器点通过玻璃纤维连接到测量设备 pH-1 SMA HP5 上。

结论

从我们的实验结果和不同的设计中，我们得出结论，通过不同连接器设计的透光率似乎并没有显着影响测量。然而，与通过玻璃烧杯进行的参考测量相比，聚合物连接器测得的 pH 值似乎发生了变化。由于玻璃是传感器指南中规定的适当反应器材料，因此可能需要进行特殊校准来应对玻璃中的光折射，这会导致使用聚合物时测量值发生变化。如果这种变化可以得到验证 - 可能通过更多和不同的设置测试 - 并且考虑到 pH-1 SMA HP5 传感器的相应位置将适合测量我们 MBR 中的 pH 值。

在之前的实验中，我们通过使用使用电极的台式 pH 计测量 pH 值，证实了 25 μg/mL 壳聚糖会导致 BY2 细胞中细胞外 pH 值升高。使用相同的处理，这项工作旨在证明 MBR 和 pH-1 SMA HP5 系统的组合可用于观察与免疫反应相关的细胞外 pH 值增加。开始处理后，15 分钟后观察到 pH 值显著升高。这种延迟可以通过处理后的 MS 需要泵入 MBR 的时间来解释。观察到的 pH 值变化表明该方法可用于筛选植物细胞上物质的免疫活性。通过使用多个通道和传感器点，将有可能建立高通量 筛选方法。此外，我们研究了由于腔室的椭圆形，MBR 培养室中营养梯度的发展。关于此评估，在更大区域（例如，使用 VisiSens 系统）中分析 pH 值将很有趣。然而，传感器箔必须打孔，营养流才能到达培养室，并且必须建立传感器箔的安装过程。