ELISA实验包被过程讲解

   包被是ELISA实验第一步，也是比较关键的一步。ELISA包被是指将抗原或抗体结合到固相载体表面的过程，也称为固相化。

1、选择合适的包被抗原
　　包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原。天然蛋白直接从生物样本中提取的抗原，例如细菌、病毒或细胞等。这类抗原接近自然状态，但也容易混杂其它物质，需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含有杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被（先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化）；重组蛋白利用基因工程技术，在宿主细胞中表达的抗原。这类抗原纯度较高，特异性好，一般可以直接包被即可；小分子抗原，例如多肽以及一些小分子有机化合物由于分子量小，缺乏足够的结合位点，直接包被的效果往往不尽如人意，一般我们会采用载体蛋白偶联法。将小分子抗原偶联到分子量较大、具有较多结合位点的载体蛋白上，例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等，借助载体蛋白的吸附能力实现间接包被。
2、选择合适的包被液
　　常见的包被液有碳酸盐缓冲液和 磷酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲液常用的ELISA包被液之一。pH值范围一般在9.0-9.6之间，呈弱碱性；磷酸盐缓冲液pH值范围一般在7.2-7.4之间，接近生理pH值。如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。
3、包被的温度
　　常见的包被温度室温（18-25°C）、 4°C(冷藏)和37°C(孵育箱)。室温（18-25°C）适用于大多数抗原和抗体。室温包被操作简便，通常需要过夜包被(12-16小时)，或在摇床上孵育2-4小时； 4°C(冷藏)这种方法可以zui大程度地保持其生物活性，但需要更长的包被时间，通常需要过夜包被(16-24小时)； 37°C(孵育箱)这种方法可以缩短包被时间，但可能会增加一些不稳定的抗原或抗体变性失活的风险。具体可以参考试剂盒说明书或相关文献来了解目标抗原或抗体的最佳包被条件。
4、包被浓度选择
　　选择合适的包被浓度对ELISA实验成功至关重要。过高过低的浓度都会影响实验的灵敏度、特异性和准确性。根据经验估计初始浓度，一般来说，蛋白质抗原和抗体的包被浓度范围在1-10µg/mL之间。小分子抗原包被浓度可能需要更高一些，例如5-20µg/mL，因为其分子量较小，结合位点较少。关于包被合适的浓度，大家可以参考具体的说明书或相关文献，也可以通过预实验优化包被浓度，例如梯度稀释法和分析结果法等。
5、包被后的封闭选择
ELISA板的表面会残留一些未被包被抗原/抗体占据的位点，这些位点容易吸附后续步骤中加入的检测抗体、酶标抗体等试剂，造成非特异性结合，导致背景信号增高，影响结果判断。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉等。大家可以进行预实验，比较不同封闭液的封闭效果，选择最佳的封闭液。