【细菌染色技术】细菌特殊结构的染色法基本介绍

　　细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、细胞壁、芽孢及异染颗粒等，用普通染色法不易着色，故需用特殊染色法。

　　1、芽孢染色法：部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。

　　孔雀绿染色法的具体步骤：首先将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染色10min，然后用自来水冲洗，冲洗完后用0.5%蕃红液复染30s，用水洗，吸干，即可镜检，镜检时芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。

　　石碳酸蕃红染色法具体步骤：首先按常规涂片，然后滴加石碳酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5min。带涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色指无红色染剂洗脱为止，接着彻di水洗，洗后用吕氏美蓝复染2-3min，水洗吸干后即可进行镜检，镜检时菌体计孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。

　　2、鞭毛染色法：鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。这里介绍一下银盐沉淀法。用作鞭毛染色的载玻片必须是绝对干净无油脂的，将载玻片在火焰上快速灼烧5s，放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL无菌水加入到幼龄生长活跃的斜面菌株中，慢慢震荡并旋转试管使菌株悬浮，尽量避免使用接种环，将悬液转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动型，用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止，放入20-30℃培养箱中培养30min，然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端，倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线，在空气中自然干燥。然后用媒染色剂媒染5min之后，慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液，用热的Fontana银盐覆盖，染色5min，每隔1min更换一次染色液（Fontana银液在沸水浴中加热），细菌涂层的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水冲洗，自然晾干即可进行镜检。应当注意一点，染色法的燃料须当日配制，4h内使用，最好是现配现用

　　3、荚膜染色：一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可以透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。荚膜染色的步骤：加一滴6%葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加1滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加1-2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。