【细胞转染实验】以24孔板siRNA转染为例

　　悬浮细胞是指细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长，如淋巴细胞。在实验室经常会遇到悬浮细胞的转染，其和贴壁细胞转染有很大的不同。

　　悬浮细胞转染通常可能遇到：1.效率明显低于贴壁细胞2.细胞不易培养，死亡率高3.转染试剂毒性大，细胞死亡加剧这三种问题，为了提高悬浮细胞的转染效率，可以使用毒性较小的非脂质体的转染试剂，也可以使用电转染方法，提高细胞转染效率，电击对细胞有一定的损伤，最好选用具有细胞膜修复功能的电转染试剂，可以将电击对细胞的伤害降到最di。

　　转染过程中，操作步骤一定要谨慎。以24孔板siRNA转染为例

　　1.提前1天细胞种植

　　悬浮细胞：采用对数生长期的细胞，数量为常规培养细胞数的1/3进行转染实验。如某细胞常规培养的细胞数是6×10^5，那么就用2×10^5的细胞进行转染。

　　2.转染过程

　　⑴取0.67μg(50pmol)的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。

　　注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

　　⑵取1μl的Entranster-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成Entranster-R4000稀释液，终体积为25μl。室温静置5分钟。

　　⑶将Entranster-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。转染复合物制备完成。

　　⑷将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。

　　注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

　　⑸转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。

　　注意：1.siRNA转染后，继续培养24-72小时在mRNA水平得到结果，继续培养24-96小时在蛋白水平得到结果。mRNA转染后，根据需要在24小时后得到结果。

　　2.在部分实验室，由于血清和培养条件等差异，转染后镜下培养基中可能出现少量黑点状沉淀，为转染试剂和血清中蛋白结合产物，不影响转染结果和细胞状态，可通过换液除去。

　　如遇转染效果不佳，可采取优化方案对实验进行优化：

　　1.优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。

　　2.同时细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。转染细胞用的质粒必须保证无菌。分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。

　　3.转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。如果质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，需要对质粒进行纯化和浓缩。

　　4.一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6×10^5个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。