免疫荧光间接法测抗体法的原理和实验步骤

免疫荧光试验定义

一种免疫标记技术。用于检测相应抗原或抗体。即用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原进行鉴定或定位。

⑴基本原理

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

⑵试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。

搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

⑶实验步骤

1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。

4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

5）将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

6）重复操作3。

7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

8）荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。

⑷注意事项

1）荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。

2）每次试验时 ，需设置以下三种对照：

① 阳性对照：阳性血清+荧光标记物

② 阴性对照：阴性血清+荧光标记物

③ 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物

3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。

4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色 。