Hepa1c1c7细胞培养（小鼠肝癌细胞）

细胞：Hepa1c1c7细胞

中文名称：人正常星形胶质细胞

生长特性：贴壁

培养基：DMEM-H培养基  血清：10%FBS（GIBCO胎牛血清）

冻存条件：50%基础培养基、40% FBS、10% DMSO

收到细胞后请尽快更换配套培养基，或自己配置的新鲜培养基（含15%血清），如因特殊情况需要继续使用原瓶培养基，请在原瓶培养基中额外添加10%的血清（原瓶培养基的继续使用时间最长不宜超过72小时）。

Hepa1c1c7细胞传代：

1）：细胞密度约80%时，吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2~3 ml 0.25% yi酶进行消化细胞（注意根据实际情况，把握消化时间）。

2）：镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时；

（可用吸管吸起些许yi酶轻轻吹打细胞层某处，即可肉眼可见细胞层脱落，或吹打后镜下观察吹打处，即消化完成，否则继续消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散。

3）：取部分细胞悬液转移到新的培养皿中，添加适当的培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。

4）：注意培养基PH值变化情况，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存。

（网络信息主针对网络推广作用，仅供参考，细胞培养请咨询细胞库管理员，以细胞库管理员提供给您的信息为准，操作前，如果有不明白之处，先咨询细胞库管理员，避免不必要的损失；）

牛流行热病毒(BEFV)核酸检测 PCR扩增:

从试剂盒中取出BEFV-PCR MIX、Taq酶系、逆转录酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。

设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：

试剂用量：BEFV-PCR MIX（20μl）逆转录酶系（1μl）Taq酶系（1μl）

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(提取RNA)或BEFV-阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并设置反应体积(25μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件:

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700,ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件：42℃→20分钟，后94℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40个循环。

LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：42℃→20分钟，94℃→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。

3. 结果分析判定

反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct 值在40以上，Ct 值小于38个循环的为阳性；Ct 值在38-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在38-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。