金樱子染料法PCR鉴定试剂盒引物设计基本原则

金樱子染料法PCR鉴定试剂盒引物设计基本原则:
1、引物长度：18-26bp，可放宽至18-30bp（有研究表明超过30bp再增加引物长度意义不大）；
2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
3、引物Tm：54-58℃，可放宽至52～62℃，GC%>60%可进一步放宽；
4、扩增子Tm：>92℃；
5、3'端：优选三联体WSS、SWS、TTS，二连体GC，单体S，尽量规避WWW、CGW、GGG、CG；
6、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
7）、末端2bp最好为GC；
8）、引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用荧光物质标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
9）、其他：避免3'端8bp及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游3'端4bp及以上反向互补，尽量避免内部回文。