水泡性口炎病毒(VSV)核酸检测实验

水泡性口炎病毒(VSV)核酸检测实验 

实验标本类型：发病动物唾液、水泡液、血清、病毒细胞培养液以及淋巴结等组织；

实验标本采集：   

动物水泡液：无菌条件下水泡液500ul左右，置入1.5ml洁净EP管。

动物淋巴结等固体组织：无菌条件下取上述组织1g左右，置入1.5ml洁净EP管。

病毒细胞培养液：取500ul左右，置入1.5ml洁净EP管。

血清：用5ml注射器无菌条件下取外周血3-5ml，置入5ml洁净干燥管中。

实验标本的保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。

实验原理：选取一对水泡性口炎病毒(VSV)核蛋白基因保守序列特异性引物和一条特异性荧光探针，应用Trizol提取RNA，经逆转录酶作用将RNA转录成cDNA，后者在Taq酶作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过一步PCR-荧光探针体外扩增法对水泡性口炎病毒(VSV)RNA进行扩增，从而达到快速检测之目的。

实验目的：适用于检测动物(猪、马、驴、牛、羊等)唾液、水泡液、血清、淋巴结等病样组织标本以及细胞培养液中水泡性口炎病毒(VSV)RNA，适用于水泡性口炎病毒(VSV)感染的辅助诊断及流行病学调查，其检测结果仅供参考。

实验样品处理：

1：固体组织：取50mg左右组织用玻璃匀浆器匀浆或剪刀剪碎，加入500ul RNA提取液A（Trizol reagents），研磨或振荡至匀浆状，转移到1.5ml的EP管中，室温放置5min。

唾液、水泡液、血清样品或病毒液：取100ul液体标本加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震荡，室温放置5min。

2：加入100ul氯仿，用力震荡15s，室温静置5min,4℃ 13,000rpm离心5min。

3：小心将上层水相转移到干净离心管中，加300ul无水乙醇，另加10ul RNA提取液B（内含不溶物，使用前室温溶解并充分混匀），充分混匀，13,000rpm离心1min。

4：弃上清，加入500ul 75%的DEPC乙醇，充分混匀，13,000rpm离心1min，小心吸去大部分乙醇。

5：将提取管敞口在室温空气中干燥5min待乙醇挥发干净，用20ul DEPC H2O溶解沉淀。

阴性质控品：取100ul阴性质控品加入500μl RNA提取液A（Trizol reagents）充分震荡，室温放置5min。后按2-5操作。

VSV-阳性质控品：直接取3μl进行PCR扩增。