上海晶抗生物干货分享流式细胞处理

在流式细胞检测实验中，除了血液样本，几乎所有的样本均为实体组织，如脾脏、肝脏、肾脏、脂肪、肿瘤等，那么为了做好流式的检测，我们首先得将实体组织消化成为活性较佳的单细胞悬液。

那么怎样得到活性较佳的单细胞悬液呢？今天小晶为大家带来客户咨询多的实体组织的单细胞悬液提取，以小鼠脾脏、小鼠肿瘤组织的提取为例，感兴趣的话就跟小晶一起往下学习吧。

一、小鼠脾脏单细胞悬液制备

脾脏是体内大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心，负责机体的造血、红细胞清除和免疫功能。一般免疫研究者很难逃过对脾脏的研究，如调节性T细胞、辅助性T细胞、巨噬细胞等的热门研究，均有脾脏的身影，那么怎么获得活性非常好的脾脏单个细胞呢？

详情步骤：

① 获取新鲜的小鼠脾脏，小鼠的脾脏呈椭圆形状，可以直接用镊子拉扯分离。将小鼠脾脏放入预冷的有适量 HBSS缓冲液的培养皿或大小适中的离心管中，并使用手术剪或眼科剪，小心将脾脏剪碎。

② 将细胞筛网放在50 mL 离心管上方，使用一次性移液器，将剪碎后的脾脏转移到细胞筛网轻轻的捣碎或碾压，使其通过筛网。必要时，加入5–10 mL PBS 冲洗。重复上述步骤，可使用1 mL注射器进行验证，若通过筛网的细胞悬液使用注射器（带针头）进行反复吹打，则可认为单细胞悬液制备完成。

③ 将流式细胞悬液在4°C下，以400-600 g 或1500 rpm 离心细胞10 min，弃上清，用2–5 mL 预冷的1x PBS 重悬细胞。将重悬液置于冰上备用，必要时可以对细胞进行台盼蓝染色初步判断活率，也可对细胞进行单细胞计数，调整至合适的细胞浓度后根据检测实验目的分别进行染色、上机检测。

二、小鼠肿瘤组织单细胞悬液制备

小鼠肿瘤发病特征和人类肿瘤很相似，因此对人类肿瘤的研究有很高的价值，而对应的小鼠肿瘤动物模型的类型及其建立方法，对肿瘤研究起到至关重要的作用。进一步，如何更好地利用实验材料验证实验结论，关键在于对肿瘤组织的检测方法。其中流式检测肿瘤组织的免疫功能就成了超级热点，那么怎么才能得到活性较好的、干扰较少的肿瘤组织单细胞悬液用于流式检测呢？跟小晶一起学习一下吧！

详情步骤：

① 沿肿瘤组织轻轻剪开，尽可能完整的剥离整个肿瘤，将剥离好的肿瘤放入预冷的有适量 HBSS缓冲液的培养皿或大小适中的离心管中，尽量冰上放置保持细胞良好活性。

② 并使用手术剪或眼科剪，小幅度、高频的方式将肿瘤块剪碎，大约剪成＜1mm2大小（肉眼看呈泥浆状），整个过程建议在冰上操作，使用适量的 PBS 进行洗涤，1500 rpm 离心10 min，沉淀的组织样本待消化。

③ 每样本加入2-3 mL 配置好的消化液（可根据肿瘤大小调整1×消化液的用量），用1 mL 枪头将肿瘤组织碎末打散，置于37 °C 恒温摇床，300 rpm 摇晃，使酶与组织充分接触，约消化30 min 左右，期间每15 min 取出吹打一次，可取一滴观察细胞分离情况，从而适当调整消化分离时间，消化时间不宜过长，以免影响免疫细胞活性。

④ 消化完毕后，加入3 mL（组织量过多可成倍加入含5%血清的 DMEM 终止消化。用巴氏吸管吸取消化后的肿瘤组织悬液至70 μm 细胞滤网过滤，同时用1 mL 注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块，所得悬液4 °C，50 g 离心10 min，收集上清，则为肿瘤细胞悬液。

⑤ 根据所购买的淋巴流式细胞分离液，对肿瘤悬液进行 PBMC 的提取，提取出中间白膜层后根据检测的实验目的分别进行染色、上机检测。