逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）实验注意事项

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）实验注意事项：

1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5． 防止DNA的污染：① 采用DNA酶处理RNA样品；② 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。