【技术干货】PCR实验中常见问题及解决方案

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。
 
我们进行核酸扩增时，经常会不定的出现一些异常问题，那么遇到这些问题该怎么解决呢？接下来跟着远慕一起来看看前辈们的经验。  
 
没有 ct 值
检测结果遇到没有 Ct 值情况,排查是否有以下问题:  
1.循环数不够  (一般不超过 45 循环，不仅背景值提高,定量也不准);  
2.PCR 程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸时采集，TaqMan 法则一般在退火结束时或延伸时采集信号，另外荧光采集是否选中。  
3.引物或探针降解。可通过 PAGE 电泳检测引物和探针是否降解;  
4.模板量可能降解或上样量不足  (不超过 5 ng，根据试剂盒说明书即可), 对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解，应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况，建议将模板样本小量分装储备，避免反复冻融;  
5.引物探针是否合适  (尤其是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物 Tm 值超过 4 ℃ 以上也会影响扩增)。  
 
ct 值过晚
在相对定量中, Ct 值一般控制在 15 ~ 25 之间比较好，如果在绝对定量中, 对低拷贝数的样品，Ct 值会增大, 但是一般不宜超过 4 循环, 否则定量不准确。. 因此，判断 Ct 值出现过晚是否属于非正常情况, 需要根据具体实验设计和目的进行。  
1.扩增效率低。引物之间或者引物和探针的比例不合适, 需要进行优化；引物或探针设计不合理，需要重新设计；  
2.PCR 程序不合适  , 改用三步法进行反应, 或者优化退火/延伸温度, 可以适当降低退火温度；退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长1s)；  
3.MgCl2 浓度不合适  ，增加镁离子浓度等。PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足；  
4.PCR 产物太长。PCR 产物设计超过 5 bp；  
5.模板中存在抑制物。用高纯度模板进行 PCR 检测或将模板进行稀释。
 
阴性对照扩增有信号
阴性对照扩增有信号排查各操作环节是否有不当,造成交叉污染:
1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。  
2.引物浓度不佳。适当降低引物浓度，并注意上下游引物的浓度配比。  
3.镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更适合的 mix 试剂盒。  
4.模板有基因组的污染。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入,或通过引物设计避免非特异性扩增。  
5.交叉污染。在所用的试剂中有交叉污染, 或操作环境中有气溶胶造成污染, 建议对操作环境进行处理, 或者更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。
 
标准曲线不佳
标准曲线线性关系不佳 R2 < .9，很有可能是以下环节存在问题:
1.标准品稀释或者加样误差  ,使得标准品不呈梯度。
2.标准品出现降解。应避免标准品反复冻融,将高浓度 DNA 模板分装,保存于 -2 ℃ 或 -8 ℃，现配现用。  
3.引物或探针不佳。重新设计更好更稳定的引物或探针。  
4.模板中存在抑制物。模板浓度过高,根据现有商品化荧光定量试剂盒的要求，一般模板量以 5 ~ 5 ng 为宜。
 
熔解曲线峰不特异
熔解曲线峰不特异很有可能是以下环节存在问题:
1.引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现；引物浓度不佳, 尤其是涉及二聚体存在时, 适当降低引物浓度, 并注意上下游引物的浓度比例;  
2.模板有基因组污染。RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异性扩增。  
3.离子浓度不合适。适当降低镁离子浓度, 或选择更适合的 mix 试剂盒, 不同试剂盒在该方面的优化能力不适合, 有些情况下可以通过更换试剂盒改善结果。
 
扩增曲线异常
遇到扩增曲线异常，比如 S 型曲线等等情况,有可能是以下环节存在问题：
1.模板的浓度太高或者降解。
2.荧光染料的降解。  
3.人为污染。在操作荧光定量 PCR 时，带上新的一次性手套,盖上避免任何指纹或者字迹等。  
4.液体挥发。耗材气密性等问题引起液体蒸发,没有很好的聚集在管子里;  
5.气泡。操作问题如移液枪加样引起的气泡问题。
 
扩增效率低
该情况适用于针对所有的基因,特别是内参基因仍无法获得较好的扩增信号时,应考虑如下情况:
1.反应试剂中部分成分比例是否最佳，另外考虑荧光染料是否降解。  
2.反应条件不够优化。可适当降低退火温度或改为三步扩增法,适当延长变性退火时间。  
3.反应体系中有 PCR 反应抑制物。一般是加入模板时所引入的,应先把模板适度稀释，再加入反应体系，减少抑制物的影响。
 
其他原因
模板反复冻融、模板长时间在紫外光下照射导致的模板发生突变；基因序列与 NCBI 上的不一致。
 
今天的讲解就到这里啦，关于PCR的这些小陷阱你了解了吗？如果有其他实验相关的问题也可以咨询我们远慕生物技术人员哦~