荧光原位杂交技术实验心得

荧光原位杂交技术（ fluorescence in situ Hybridization,FISH）是一种非放射性原位杂交方法，用特殊的荧光素标记核酸探针，在细胞或组织切片标本上进行杂交，以检测细胞内 DNA 或 RNA 特定序列存在与否。

FISH 实验操作与用非荧光标记探针的原位杂交基本相似。在组织准备方面，新鲜组织、冷冻组织样本、细胞涂片、培养细胞爬片等材料均可以用于进行FISH 实验检测。

以下谈谈用细胞爬片进行 RNA FISH 检测的一些总结。

一、实验流程

1. 细胞在盖玻片上进行培养，细胞长好后用 CSK 缓冲液简单洗涤。

2. 细胞爬片用 4% 多聚甲醛在 4℃ 固定 10 min。

3. 用含有 0.5% TritonX-100,，10 mM VRC 的 CSKBuffer 溶液在 4℃ 处理 10-12 min。

4. 用 70% 酒精，4℃，孵育 10 min。

5. 在-20℃, 分别用 70%，85% 和 100% 的酒精处理 5 min，进行脱水，最后风干。

然后用中性树胶将细胞爬片粘在载玻片上 （正面朝上）。

6. 探针的准备，将加了探针的杂交缓冲液置于 76℃ 变性处理 10 min。

7. 将 5ul 杂交混合液滴在爬片上，盖上盖玻片，经 Rubber Cement 橡胶封片，置于潮湿暗盒中 37 ℃ 杂交过夜。

8. 杂交后，去除橡胶和盖玻片，爬片用 50% 甲酰胺 (2XSSC 配) 在 42℃，洗 5 minX3，然后用 2XSSC 在42℃，洗 5 minX3。

9.DAPI 复染，取适量 DAPI 储存液用 PBS 稀释至 1ug/ml 的工作液，吸 5μL 滴爬片上，盖上盖玻片，黑暗室温孵育 5min。去掉盖玻片，在 PBS 中洗涤 2 次。去掉过量液体，滴加 antifade reagent 封片。

10. 荧光显微镜下观察

二、注意事项

1、做 RNA FISH 实验，首先要防止 RNA酶的污染。操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换。所有实验用到玻璃制品都要高温灭菌，且各种溶液要用 DEPC 水配制。

2、去污剂 triton X-100 处理的目的是增加细胞的通透性，利于杂交探针进入细胞，其处理时间因应不同的细胞而有所不同。注意：过度的去污剂处可能会引起靶核酸的丢失。

3、荧光见光就会淬灭，因此操作过程要做好避光。

4、将细胞爬片粘在载玻片上，确保有细胞的那面朝上。

5、实验所用探针是双链 DNA 探针，而杂交反应进行时，探针和靶核酸都必须是单链的。因此在做 RNA FISH 杂交前，探针必须进行变性。探针变性后要立即进行杂交反应，不然解链的探针又会重新复性。

6、探针的浓度因其种类和实验要求而有所不同，一般为 0.5-5ng/ul。合适的探针浓度要通过实验才能确定。

7、杂交反应时，盖玻片不可有气泡，不然妨碍探针与细胞的接触。

8、玻片经 antifade reagent 封片后可在 4℃ 暗处保存 2-3 星期而不失去全部荧光，但 FISH 操作完成后要及时观察采图。

9、如果镜检时，观察到有非特异结合造成的高背景。可能原因有：不合适的探针量，不适合的杂交后洗涤，又或者是样本中有过多的重复序列。解决方法：1）使用合适的探针量；2）改善杂交后的洗涤，如洗涤液要新鲜配制，增加洗涤液的量，延长洗涤时间等；3）使用 DNA 阻断剂，在探针中加入一定量的 DNA 竞争性阻断剂如 COT-1 DNA 或鲑精 DNA 来竞争性结合基因组中重复性片段。