免疫荧光技术直接法测抗原实验步骤

免疫荧光技术直接法测抗原实验步骤

⑴基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

⑵试剂与仪器

磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释

缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)

有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)

荧光显微镜

玻片架

滤纸

37℃温箱等。

⑶实验步骤

① 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。

② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其wan全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。

③ 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。

④ 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。

⑤ 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:

(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。

⑷注意事项

1)对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。

2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3)为了保证荧光染色的正确性,shou次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

① 标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。

② 特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。

③ 阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。

4)一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。