搞定蛋白表达，只需弄清这几点！

蛋白表达问题一直备受关注，如何实现蛋白高效表达这个老生常谈的话题，今天远慕来探讨一下。

影响蛋白表达的因素主要有：

1.载体构建错误
这个是很多克隆新人常犯的错误，在克隆时弄错读码框，从而导致蛋白不表达。蛋白表达载体构建正确是蛋白表达实验的基础，构建载体时要考虑启动子、多克隆位点、终止子、融合标签、复制子等多种因素。

2.宿主菌选择不当
不同宿主菌的基因型不同，选择合适的宿主菌对某些特殊的载体进行蛋白表达至关重要。有时表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，会造成质粒丢失。

3.GC含量
不同物种间基因组的GC含量有显著差异，GC含量通常间接对基因表达进行调控和影响，超过70%可能会减低蛋白表达水平。

4.密码子优化

（1）密码子偏爱性
不同物种的基因在密码子使用上存在着明显的偏爱性，甚至同物种内不同功能的基因其密码子使用频率也存在较大的差异，密码子偏爱性对重组蛋白的表达具有深刻复杂的影响。
密码子的偏爱性是通过控制可用tRNA丰度影响蛋白的翻译过程，tRNA的缺乏可能导致对应的稀有密码子在蛋白表达过程中使翻译速率降低甚至终止，从而使蛋白水平显著降低。

（2）密码子的使用频率低。
某些基因本身含稀有密码子，拥有所用宿主的稀有密码子越多的基因，越难在该宿主中表达出理想水平的重组蛋白。可选用高频使用的密码子替代基因中存在的已选宿主的稀有密码子，或在排除原始基因中的稀有密码子的基础上进行重新合成，同时使密码子组成频率更接近宿主。
但是研究表明，密码子的优化必须与蛋白的高级结构联系起来，如果通过一味地替换稀有密码子来提高重组蛋白的表达可能会起到适得其反的结果。

5.mRNA二级结构

mRNA如果形成大而稳定的二级结构如发卡结构和茎环结构，尤其是起始密码子附近的稳定二级结构，将会影响mRNA在翻译过程中核糖体的结合和延伸，从而降低翻译的效率和最终的蛋白表达水平。
如果序列里有和核糖体结合位点/或翻译起始位点互补的序列，由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止，此时就需要进行同义密码子替换。
因此，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，将有效提高目的蛋白表达水平。

6.mRNA的稳定性

蛋白的表达调控分为转录水平和翻译水平，一般来说，转录水平起关键作用，但同时翻译的效率与mRNA的降解直接相关，因此，也间接影响着转录后水平的调控。原核表达中，存在稀有密码子的mRNA翻译过程受到影响，使得mRNA得不到更多核糖体结合后的有效保护，也将导致mRNA的降解从而使蛋白积累水平显著降低。

7.基因突变

碱基的缺失、插入或突变，都会对翻译的蛋白产生影响，在PCR扩增时，碱基序列突变为终止密码子，会导致蛋白翻译意外终止。所以在进行表达之前，通常要进行测序来避免这种情况的发生。

当然，影响蛋白表达的其他要素或优化方法，还包括检查单核苷酸重复和密码子重复，起始密码子环境，终止密码子及其环境，避免内含子、AT 富含区、内部核糖体进入位点 (IRES)、重组位点等不利元件，选择合适的 UTR 序列和信号肽序列，合理设计酶切位点、接头、融合基因、检测和纯化标签等。其他影响蛋白表达因素，欢迎小伙伴们补充。