石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤

石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤（建议方案）：

石蜡包埋组织切片 3~4μm 厚度

1.烤片： 将待做切片置于切片架上，于 60℃恒温烤箱中至少烤 1 hr；

2.脱蜡： 切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡 3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次

10 min；

3.水化： 切片经下行酒精水化，无水乙醇 5min，95%乙醇 2 次（每次 2min），85%

乙醇 2 min；75%乙醇 2min，自来水冲洗，ddH2O 洗 2×2min；

4.抗原修复： 根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温

度达到 98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O 洗 2×

2min，TBS 洗涤（2×2min）（具体修复方法见附 1）* 注：有些抗原勿需修复，

直接进入第 5 步封闭。

5.封闭： 滴加试剂 B，37℃湿盒孵育 30 min；

6.加一抗：滴加用试剂 C（即用型一抗），37℃湿盒孵育 2 hr 或 4℃过夜；

7.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

8.封闭： 滴加试剂 B，37℃湿盒孵育 10 min；

9.加二抗： 滴加用抗体稀释液稀释的生物su 化二抗（试剂 D），37℃湿盒中孵育

30 min；

10.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min）；

11.封闭： 滴加试剂 Tween 20，37℃湿盒孵育封闭 20 min；

12.加 HRP-SA： 滴加用试剂 C 稀释的试剂 E（1：50~200，终浓度 5~20 nM），37

℃湿盒中孵育 30 min；

13.洗涤： TBS-T 洗涤（3×5 min），TBS 洗涤（2×5 min）；

14.显色：应用 DAB 溶液（试剂 F）显色；

15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；

16.封片： 待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；

17.观察成像： 显微镜下观察成像。